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潮霉素B液體和干粉原來是這樣操作!

發(fā)布時(shí)間: 2018-12-05  點(diǎn)擊次數(shù): 2680次

潮霉素B液體和干粉原來是這樣操作!

 

潮霉素B(Hygromycin B)是由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素,通過干擾70S核糖體易位和誘導(dǎo)對mRNA模板的錯(cuò)讀而抑制蛋白合成,從而殺死原核(如細(xì)菌)、真核(如酵母菌,真菌)和高等哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞。

 

液體:無菌的潮霉素B溶液(100mg/ml),可直接用培養(yǎng)液稀釋使用。

干粉:本品是潮霉素B干粉,用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)溶解后過濾除菌。溶劑水,PBS溶液。

 

常用篩選濃度

注意:潮霉素B用來篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型,培養(yǎng)基,生長條件和細(xì)胞代謝率而變化,使用濃度為50-1000μg/mL。對于次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過建立殺滅曲線(kill curve),即劑量反應(yīng)性曲線,來確定*篩選濃度。

一般而言,哺乳動(dòng)物細(xì)胞50-500μg/mL;細(xì)菌/植物細(xì)胞20-200μg/mL;真菌300-1000μg/mL。

 

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

1)     轉(zhuǎn)染48h后,用含有適當(dāng)濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞(直接傳代或者稀釋后傳代)。

注意:細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果。則當(dāng)細(xì)胞過于稠密,其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果,將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%。

2) 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

3)  篩選7天后觀察并評估細(xì)胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間,這取決于宿主細(xì)胞類型,轉(zhuǎn)染,以及篩選效果。

4) 挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細(xì)胞培養(yǎng)板,繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

5) 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

 

注意事項(xiàng)

1) 潮霉素B的抗性基因(hyg或hph)除了來自E. Coli.之外,還發(fā)現(xiàn)于其他的菌株,包括Streptomyces hygroscopicus和Klebsiella pneumoniae。

2) 本品為有毒化合物,避免與皮膚和眼睛接觸,請小心操作。

3) 為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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