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原位雜交的實(shí)驗(yàn)操作步驟

發(fā)布時(shí)間: 2023-10-16  點(diǎn)擊次數(shù): 1064次

原位雜交的實(shí)驗(yàn)操作步驟

信帆生物提供原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)服務(wù)。操作步驟如下:

1.組織固定:組織取出PBS漂洗后立即放入原位雜交固定液(動(dòng)物)中固定12h以上,4°保存運(yùn)輸。

2.脫水:固定后在通風(fēng)櫥內(nèi)切取目的區(qū)域組織塊約3mm厚,放入15%蔗糖溶液中8h,后換30%蔗糖溶液中過(guò)夜。

3.冰凍切片固定:冰凍切片室溫晾干,置于原位雜交固定液(動(dòng)物)固定10min,于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

4.修復(fù)及消化:根據(jù)組織類(lèi)型,固定時(shí)間長(zhǎng)短及指標(biāo)的定位,選用不同的修復(fù)液進(jìn)行修復(fù),具體修復(fù)條件見(jiàn)上表。自然冷卻后組化筆畫(huà)圈,根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化,消化時(shí)間見(jiàn)上表。純水沖洗后PBS洗3次,每次5min。

5.阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:滴加3%甲醇-H2O2,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

6.預(yù)雜交:滴加預(yù)雜交液,37°C孵育1h。

7.雜交:傾去預(yù)雜交液,滴加含探針雜交液, 恒溫箱雜交過(guò)夜。雜交條件見(jiàn)上表。

8.雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。

9. 滴加對(duì)應(yīng)的分支探針雜交:輕輕甩干切片,滴加已預(yù)熱的相應(yīng)的分支探針雜交液(見(jiàn)上表及附表)(60 μL),水平置于濕盒內(nèi)40℃雜交45 min。此過(guò)程中在濕盒底部加入50ml 2× SSC,防止干片。

10.雜交后洗滌:傾去雜交液,將切片依次用40°C預(yù)熱的2× SSC、1× SSC、0.5× SSC、0.1× SSC于40°C漂洗5 min。注:若非特異性雜交體較多,可以在此步增加洗滌時(shí)間、次數(shù)及調(diào)整雜交液中甲酰胺濃度。

11. 滴加對(duì)應(yīng)的信號(hào)探針:滴加含信號(hào)探針(見(jiàn)上表及附表)雜交液,稀釋比1:400.42°孵育3h。后依次經(jīng)過(guò)以下SSC洗滌:2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC 37°洗10min。

12.血清封閉:滴加封閉血清正常兔血清 室溫孵育30min。

13. 孵育HRP標(biāo)記鼠抗-地-高-辛抗體(HRP-anti-DIG ):傾去血清封閉液,滴加HRP- anti-DIG。37°孵育50min,后PBS洗5min  4次。

14.DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時(shí)間,陽(yáng)性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色。

15.復(fù)染細(xì)胞核:蘇木素染液復(fù)染3min左右,自來(lái)水洗,蘇木素分化液分化數(shù)秒,自來(lái)水洗,蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)1min,流水沖洗。

16.脫水封片:將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I(xiàn) 6min—100%酒精I(xiàn)I 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,將切片從二甲苯中拿出稍晾干后,封片劑封片。

結(jié)果判讀:陽(yáng)性為棕黃色,細(xì)胞核為藍(lán)色。

送樣要求:

1、切片前處理要求:新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片;或取2mm左右厚度的新鮮組織,5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定,4℃低溫保存運(yùn)輸,切勿冷凍結(jié)冰,盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn),固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響核酸檢出率;

2、冰凍切片:冰凍切片-20℃運(yùn)輸;

3、石蠟切片:石蠟切片常溫運(yùn)輸;

4、細(xì)胞爬片:細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,換無(wú)酶PBS,密封,4℃運(yùn)輸。

原位雜交的實(shí)驗(yàn)操作步驟

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