Western Blot中關(guān)于抗體的相關(guān)問題！

1、做細(xì)胞信號傳導(dǎo)，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

解答：對二抗無要求，要看你實(shí)驗條件來選擇，一般用HRP標(biāo)記的二抗。

2、同一公司的不同抗體用某個稀釋度對一種抗體效果好，另外一種抗體可不可以用同種稀釋度進(jìn)行稀釋？
解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其*的抗體稀釋度也是不一樣的，需要進(jìn)行實(shí)驗摸索。
 

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3、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
解答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）

4、Western Blot 中抗體的重復(fù)應(yīng)用問題
解答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4℃保存，避免反復(fù)凍融。

5、做western每次只加一種一抗，可以同時加兩種或者多種一抗的嗎？
解答：還是不要同時加兩種一抗。因為如果結(jié)果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。 

6、酶顯色與熒光顯色之間，各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？
解答：免疫酶技術(shù)就是用酶（如辣根過氧化物酶）標(biāo)記已知抗體（或抗原），然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)，如果組織中含有相應(yīng)抗原（或抗體），抗原抗體相互結(jié)合形成的復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，這樣就可以識別出標(biāo)本抗原（抗體）分布的位置和性質(zhì)，通過圖像分析并可達(dá)到定量的目的。

免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究與診斷，但是熒光抗體染色標(biāo)本不能保存，對組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，免疫酶技術(shù)則能克服上述不足，標(biāo)記免疫酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法，對石蠟切片標(biāo)本尤為適用，為免疫病理研究開辟了一條新途徑，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過適當(dāng)處理還可以進(jìn)行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術(shù)分為酶標(biāo)記法與非標(biāo)記抗體技術(shù)，前者是將酶通過交聯(lián)劑結(jié)合在抗體分子上，形成酶標(biāo)記抗體。后者是將酶作為抗原與相應(yīng)的特異性抗體連接進(jìn)行的免疫反應(yīng)，稱為非標(biāo)記抗體酶技術(shù)。

Western Blot中關(guān)于抗體的相關(guān)問題！