信帆生物-免疫組化試劑盒常用的染色方法

分類：
免疫組織化學(xué)技術(shù)按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等。

作用：
實驗所用的標本
實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本常用、基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復(fù)，是免疫組化中選的組織標本制作方法。

實驗所用的抗體：
免疫組化實驗中常用的抗體為單隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。

常用的染色方法
根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法常用。

免疫組化主要步驟

1.洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)的組織帶負電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。

2.包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，加入少許液體石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。

3.切片：將包埋好的組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機上，切片機通過調(diào)節(jié)上下左右來來使組織和切割方向一致，然后調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5µm,如果比較難切，則可以適當調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。

4.撈組織：當組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候方向一致，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。

5.脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為12-15min.

6.抗原修復(fù)：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。

7.血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。

8.加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。

9.加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。

10.加SABC:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。

11.加顯色劑：將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩沖液

12. 復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。

13.脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。

14.封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。 

信帆生物-免疫組化試劑盒常用的染色方法